PCR擴(kuò)增儀|PCR基因擴(kuò)增儀|PCR常見(jiàn)問(wèn)題
一、沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物 1、循環(huán)溫度：變性溫度、退火溫度 2、引物設(shè)計(jì) 3、DNA聚合酶活性 4、抑制性成份(蛋白酶、核酸酶、其它抑制聚合酶活性的成份) 5、DNA樣品
二、非特異產(chǎn)物及電泳呈涂布狀 1、Mg2+濃度 2、調(diào)整引物、模板、聚合酶的用量 3、適當(dāng)減少循環(huán)數(shù) 4、適當(dāng)提高退火溫度，縮短退火或延伸時(shí)間?
三、引物二聚體的形成 1、檢查引物的序列 2、提高退火溫度 3、調(diào)整引物與模板濃度 4、增加引物長(zhǎng)度
四、假陽(yáng)性結(jié)果的預(yù)防 1、實(shí)驗(yàn)器材應(yīng)一次性使用(吸咀、PCR管) 2、注意操作環(huán)境，戴一次性手套 3、嚴(yán)格PCR操作規(guī)程 4、多次取樣的試劑應(yīng)分裝 5、設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照
PCR相關(guān)技術(shù)
一、錨定PCR(anchored PCR)：引進(jìn)錨定引物，可以幫助克服序列未知或序列未全知的障礙。在DNA3’-末端加上poly(dG)尾，與此相對(duì)應(yīng)的錨定引物poly(dC)一般應(yīng)在十二聚以上。
二、稱PCR(asymmetric PCR)不對(duì)稱PCR主要是在PCR體系中設(shè)計(jì)不同的引物濃度，兩條引物濃度比為1：50或1：100，前12個(gè)循環(huán)兩條模板等量擴(kuò)增，之后低濃度引物消耗殆盡，其擴(kuò)增產(chǎn)物減少以至于無(wú)；而高濃度引物介導(dǎo)產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物（即單鏈DNA）逐漸增加，可得到大量單鏈DNA（ssDNA）用于直接測(cè)序。
三、反向PCR(inverse PCR)
四、多重PCR(multiplex PCR) 多重PCR是用多對(duì)引物同時(shí)對(duì)模板DNA上的多個(gè)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。多重PCR技術(shù)的難點(diǎn)不是在于其原理和操作的復(fù)雜性，而是在于其多對(duì)引物的設(shè)計(jì)，必需保證多對(duì)引物之間不形成引物二聚體，引物與目標(biāo)模板區(qū)域具有高度特異性。應(yīng)用于基因診斷，對(duì)與疾病相關(guān)的基因（龐大）進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。
五、逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse?transcription?PCR,RT-PCR) 由mRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA鏈作為PCR反應(yīng)模板。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA時(shí)，引物可選用特異引物、隨機(jī)六聚體引物或寡聚dT(12-18)。設(shè)計(jì)RT-PCR的引物時(shí)最好是分散在不同的外顯子上，以免基因組DNA的污染導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。
六、差別PCR(differential PCR) 差別PCR是將靶基因與已知拷貝的參照基因置于同一PCR反應(yīng)體系中，用同一套引物進(jìn)行擴(kuò)增，電泳染色后可根據(jù)參照基因的擴(kuò)增產(chǎn)物與待測(cè)基因擴(kuò)增產(chǎn)物的相對(duì)豐度對(duì)待測(cè)基因進(jìn)行定量。
七、原位PCR(In situ PCR) 原位PCR是指在組織或細(xì)胞標(biāo)本片上直接進(jìn)行PCR，對(duì)細(xì)胞中的靶DNA進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)摻入標(biāo)記基團(tuán)直接顯色或結(jié)合原位雜交進(jìn)行檢測(cè)的方法。可分為直接法和間接法。基本步驟：組織切片或細(xì)胞固定→蛋白酶消化→原位PCR擴(kuò)增→沖洗→產(chǎn)物檢測(cè)優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，可進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。
八、熒光定量PCR(FQ-PCR) 熒光定量PCR：融匯PCR技術(shù)、DNA探針雜交技術(shù)(標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán))，結(jié)合先進(jìn)的光譜檢測(cè)技術(shù)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)。主要原理是在待擴(kuò)增區(qū)域結(jié)合上DNA探針，PCR過(guò)程中，具有5’→3’外切酶活性的Taq酶延伸引物鏈到DNA探針時(shí)，將DNA探針逐個(gè)降解，釋放出熒光報(bào)告基團(tuán)，這樣PCR體系中熒光的強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物量之間存在正比關(guān)系，可通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度而對(duì)PCR產(chǎn)物定量。