PCR的要素

　　基本的PCR須具備

 

　　1.要被復(fù)制的DNA模板 Template

  

 

        2.界定復(fù)制范圍兩端的引物Primers.

 

　　3.DNA聚合酶Taq. Polymearse

 

　　4.合成的原料（四種脫氧核苷酸）及水。

PCR的反應(yīng)包括三個主要步驟

　　分別是1. Denaturation 2. Annealing of primers,3. Extension of primers。 所謂 Denaturing乃是將DNA加熱（至90~95℃）變性， 將雙股的DNA加熱后轉(zhuǎn)為單股DNA以做為復(fù)制的模板. 而Annealing 則是令 Primers于一定的溫度下（冷卻至55~60℃）附著于模板DNA兩端。 最后在DNA聚合酶e.g. Taq-polymerase 的作用下（加熱至70~75℃）進行引物的延長 Extension of primers及另一股的合成。

　　PCR的最早設(shè)想 核酸研究已有100多年的歷史，本世紀(jì)60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)，Korana于1971年最早提出核酸體外擴增的設(shè)想：“經(jīng)過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”。

PCR的實現(xiàn)

　　1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是

PCR的改進與完善

　　Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片

　　段，其缺點是：

　?、貹lenow酶不耐高溫， 90℃會變性失活，每次循環(huán)都要重新加。

　?、谝镦溠由旆磻?yīng)在37℃下進行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的

　　DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術(shù)雖較傳統(tǒng)的基因擴增具備許多突出的優(yōu)點，

　　但由于Klenow酶不耐熱，在DNA模板進行熱變性時，會導(dǎo)致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成

　　一個擴增反應(yīng)周期，給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得PCR技術(shù)在一段時間內(nèi)沒能引

　　起生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視。

　　1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進行PCR，其擴增的DNA片段很均一，真實性也較

　　高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。

　　1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌thermus aquaticus 中提取到一種

　　耐熱DNA聚合酶。 此酶具有以下特點：①耐高溫，在70℃下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來的

　　90%，在93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%，在95℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的40

　　%。②在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應(yīng)后再加新酶。③大大提高了擴增片段特異

　　性和擴增效率，增加了擴增長度2.0Kb。由于提高了擴增的特異性和效率，因而其靈敏性也

　　大大提高。為與大腸桿菌多聚酶I Klenow片段區(qū)別，將此酶命名為Taq DNA多聚酶Taq DNA

　　Polymerase。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用。